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本制品是基于可见光及荧光双染料LAMP扩增技术开发的简单快捷的蛙病毒检测试剂盒。

蛙病毒(Ranavirus)属于虹彩病毒科，为双链DNA病毒，基因组大小约为150kb～170kb，病毒粒子直径150nm～170nm，。感染后病蛙精神不振，行动迟缓，食欲减退，接着在蛙的体表有出血点，幼蛙背部皮肤开始局部坏死脱落，很快烂斑扩大，病情不断加重。主要危害蛙，病程短，蔓延快，一旦发病，仅2～3天蛙群中的死亡率达90%，给蛙养殖业造成严重损失。因此快速检测蛙病毒具有重要意义。

1. 即开即用，用户只需要提供DNA样品。
   
2. 恒温扩增，可以不需要荧光PCR等贵重仪器。
   
3. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
   
4. 检测灵敏度一般比PCR高10倍以上。
   
5. 特异性高，根据蛙病毒DNA保守序列设计4条特异引物，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应，能检测本属的主要物种，包括Bohle iridovirus、Frog virus 3、Testudo iridovirus、Rana esculenta iridovirus等。
   
6. 一般30分钟内出结果，比PCR快。
   
7. 上样量大，对20μL的反应体系，最大样品加样量高达14μL。
   
8. 内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
   
9. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
   
10. 本制品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
    
11. 本制品足够50次20μL体系的荧光及可视化LAMP扩增。
    
12. 只可用于科研。

1. 用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
   
2. 如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照(PC)和一个样品制备阴性对照(NC)。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照(10⁴拷贝/μL)加一定量的水作为样品制备PC，加水后的总体积跟所用核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用水替代。

3. 反应设置：第一次使用时请把所有Bst DNA聚合酶2.0(50μL，本试剂盒提供)加入到4×LAMP MasterMix(双染料，待加酶)中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+4个LAMP扩增，增加LAMP扩增阳性对照和LAMP扩增阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
   

   成分	N+2个 样品管	LAMP 阴性对照	LAMP 阳性对照
   4×LAMP Master Mix(双染料，已加酶)	各5μL	5μL	5μL
   20×蛙病毒LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
   N+2个样品DNA	各14μL	不加	不加
   超纯水	不加	14μL	不加
   第2步所得阳性对照的10倍稀释液	不加	不加	14μL

4. 如果使用金属浴或水浴保温，没有热盖，则每个反应管中加入50μL自备的PCR级石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发到管盖下方凝集，反应体积变化，会严重影响反应效率，增加假阳性率。最后置于65℃保温60分钟进行扩增。
   
5. 如果使用常规PCR仪进行LAMP反应，设置程序时必须打开热盖，设置成65℃保温60分钟进行扩增。
   
6. 如果使用荧光定量PCR仪，则设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。

7. 电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP阳性对照必须有正常LAMP条带(200bp左右的梯形扩增产物)，LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：
   
   
8. 可见光(肉眼)分析：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和LAMP阴性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可将光检测结果见左图(9为阴性、10为阳性)。
   
   
9. 荧光分析(仅限于用qPCR仪进行反应的场景)：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。